Mikrokalorymetryczne badania przemian konformacyjnych albuminy poddanej działaniu wybranych czynników fizykochemicznych

Z notatki wydawniczej :

W pracy przedstawiono i przedyskutowano wyniki badań przemian strukturalnych surowiczej albuminy ludzkiej i wołowej, przebiegających pod wpływem kontrolowanego wzrostu temperatury w roztworach wodnych. Zastosowanie wysokiej jakości czułego mikrokalorymetru pozwoliło prześledzić subtelne zmiany zachodzące w białku pod wpływem takich czynników środowiskowych, jak radiowe (RF) i ultrafioletowe (UV) promieniowanie elektromagnetyczne. Udokumentowano występowanie różnic w przebiegu termicznego rozfałdowania albuminy wolnej i zawierającej kwasy tłuszczowe, reakcji obydwu form białka na promieniowanie UV oraz w wiązaniu denaturantów (etanolu).
Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem matematycznym pozwoliło scharakteryzować założony proces termicznej denaturacji trójdomenowego białka, jakim jest albumina.

WPROWADZENIE :

Inspiracją do badań przemian konformacyjnych białek zachodzących pod wpływem czynników fizykochemicznych jest wiele niewyjaśnionych w pełni kwestii dotyczących zależności pomiędzy zmianą natywnej struktury białek w wyniku oddziaływania ze środowiskiem a skutkami, jakie te modyfikacje niosą dla organizmów żywych. Narażenie środowiskowe jest zazwyczaj narażeniem mieszanym na wiele czynników o różnych stężeniach bądź natężeniach.
Efekt końcowy jednoczesnego działania wielu czynników zależy od interakcji między nimi, a w przypadku organizmów żywych także od ich indywidualnych reakcji i odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Prowadzenie badań in vitro, mających na celu poznanie wpływu każdego z czynników oddzielnie lub ich ograniczonej kombinacji nie na obiekty żywe, lecz na ich wyodrębnione składniki, nie jest w stanie zastąpić badań in vivo.
Jedną z wielu przyczyn jest trudność wiernego odtworzenia warunków fizjologicznych, na przykład tzw. zatłoczenia molekularnego panującego w komórce, od którego w bardzo istotny sposób uzależnione są konformacje makromolekuł, aktywność enzymów i szybkość reakcji biochemicznych (MINTON, 2001, 2005; ELLIS, 2001; CHEBOTAREVA et al., 2004). Na obecnym etapie wiedzy selektywne badania modelowe, mimo określonych założeń upraszczających, nadal wnoszą istotny wkład w poznanie i zrozumienie zjawisk fizycznych leżących u podłoża procesów, wywołujących określone skutki w danych warunkach środowiskowych.
Białka, podstawowe składniki każdej komórki, biorą udział w licznych procesach fizjologicznych: przenoszeniu i magazynowaniu różnych substancji, utlenianiu tkankowym, krzepnięciu krwi, procesach odpornościowych, procesach widzenia, przewodzeniu bodźców nerwowych, skurczu mięśni, dostarczaniu energii, regulacji procesów metabolicznych — stężenia jonów, ciśnienia osmotycznego.
Wszystkie te funkcje wypełniają one dzięki odwracalnym zmianom specyficznej struktury przestrzennej każdego z nich.
Zdobycie wszechstronnych informacji na temat trwałości struktur białkowych jest ważne w aspekcie współczesnych badań farmaceutycznych. W ostatnich latach powstaje wiele nowych leków na bazie białek, przy czym największym problemem jest zwykle mała trwałość tych farmaceutyków. Dodatkowo procesy technologiczne prowadzące do ostatecznej formy bezpiecznego i skutecznego (aktywnego) preparatu, składają się z procedur, które mogą modyfikować białko w niepożądany sposób.
Wyjściowy materiał poddawany jest np. działaniu promieniowania jonizującego, UV (254 nm) czy termicznej sterylizacji w celu zniszczenia bakterii i wirusów.
Te działania nie pozostają prawdopodobnie bez wpływu na strukturę i właściwości makromolekuł.
Albumina jest to białko surowicy krwi, które obficie występuje w organizmach ssaków.
Pomimo tego że zarówno struktura, jak i podstawowe funkcje albuminy zostały stosunkowo dobrze poznane, nie przestaje ona być obiektem wszechstronnych badań naukowych.
Wybrane, zdaniem autorki ważne w kontekście pracy, informacje na temat tego białka przedstawiono w rozdziale 2. Poznanie wpływu różnych czynników fizykochemicznych na właściwości albuminy przyczynia się do zrozumienia zaburzeń jej funkcji.
Termiczne charakterystyki albuminy dostarczają cennych wskazówek w kontekście jej zastosowań praktycznych, np. w laserowym zespalaniu tkanek (BLEUSTEIN et al., 2000 a, b), metodzie alternatywnej do zszywania chirurgicznego. Albuminy używa się jako „lutu” w celu poprawy konsystencji i zwiększenia wytrzymałości blizny. Termiczna pasteryzacja roztworów albuminy poprzedza ich zastosowania kliniczne (przeprowadza się ją ze względu na możliwość obecności wirusów, np. HIV, opryszczki, zapalenia wątroby).
Badania termicznej denaturacji albuminy dostarczają ważnych informacji na temat wewnątrz- i międzydomenowych oddziaływań istotnych dla stabilizacji aktywnej formy białka.
Zachowanie się albuminy pod wpływem temperatury badano różnymi metodami, a najczęściej techniką dichroizmu kołowego (CD) (TAKEDA et al., 1989; ARAKAWA et al., 2000; WATANABE et al., 2001; KRAGH-HANSEN et al., 2005) i różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) (ANRAKU et al., 2007; BARONE et al., 1995; FARRUGGIA, PICÓ, 1999; GIANCOLA et al., 1997; MICHNIK, 2003; ROSS, SHRAKE, 1988; TIKTOPULO et al., 1985; YAMASAKI et al., 1990, 1991, 1992).
Nowoczesna aparatura pozwala na badanie zmian zachodzących w strukturze białek na poziomie molekularnym. Uchwycenie tych zmian i powiązanie ich z funkcjami białek wzbogaca wiedzę dotyczącą prawidłowości funkcjonowania naszych organizmów, a także podłoża niektórych chorób. Zaburzenia konformacyjne białek leżą u podstaw takich chorób układu pozapiramidowego jak: choroba Parkinsona, otępienie, z ciałami Lewy’ego (ang. Dementia with Lewy bodies — DLB), postępujące porażenie nadjądrowe. Nieprawidłowa struktura białek ma także związek z chorobą Alzheimera i chorobą prionową BSE.
Relacje między strukturą a funkcją białek zależą silnie od oddziaływań z rozpuszczalnikiem.
Problem ten jest szeroko badany od wielu lat i mimo to wciąż żywo dyskutowany.
Ponieważ większość białek funkcjonuje w roztworach wodnych, znaczenie wody i zrozumienie różnych aspektów oddziaływań w środowisku wodnym jest szczególnie ważne.
Aktywność białka oraz jego konformacyjna elastyczność są w dużym stopniu uwarunkowane obecnością wody.
Struktura natywnych białek jest określona przez równowagę wewnątrz- i międzymolekularnych oddziaływań pomiędzy różnymi resztami aminokwasowymi oraz tymi resztami i molekułami wody otaczającymi białka. Ta równowaga określa tendencję poszczególnych reszt aminokwasowych do preferowania wnętrza lub powierzchni białka.
Może być zmieniona np. przez denaturanty czy stabilizatory obecne w roztworze, jak również przez zmiany temperatury, ciśnienia, pH czy siły jonowej.
Ogólna struktura białek jest wtedy osłabiana lub wzmacniana, zależnie od właściwości molekuł.
Badanie tych zmian dostarcza wartościowej informacji na temat roli rozpuszczalnika w utrzymaniu konformacji natywnego białka. Krótkie omówienie oddziaływań istotnych dla stabilizacji struktury białka oraz czynników modyfikujących ją zawarto w rozdziałach D II i D III Dodatku.
Od dawna bada się wpływ podstawowych czynników fizycznych: temperatury i ciśnienia, na trwałość struktur białkowych. Paradoksalnie, śledzenie procesu denaturacji, a więc niszczenia struktury białka, pozwala lepiej poznać i zrozumieć oddziaływania kluczowe w procesie fałdowania białka do specyficznej dla niego konformacji oraz istotne dla stabilizacji tej struktury. Większość zagadnień dyskutowanych w tej pracy skupia się wokół termicznej denaturacji białek, a pewne aspekty denaturacji ciśnieniowej przedyskutowano w rozdziale D III Dodatku.
Konformacja białka może być również zmieniana pod wpływem innych czynników fizycznych, np. jonizującego promieniowania gamma (SZWEDA-LEWANDOWSKA et al., 1976; FESSAS et al., 1998; LEE et al., 2000; LEE, SONG, 2002; CHO, SONG, 2000; CIEŚLA et al., 2000).
Autorzy niektórych prac zwracają uwagę, że także podczas badań krystalograficznych struktury białek promieniami X ulega ona zmianie, co powoduje różnice pomiędzy strukturami: natywną i stwierdzoną na podstawie eksperymentu dyfrakcyjnego (NAVE, 1995; CARUGO, CARUGO, 2005).
Wyniki badań mikrokalorymetrycznych prezentowane w tej pracy wykazały, że także promieniowanie elektromagnetyczne niejonizujące z zakresu UV oraz radiowego prowadzi do strukturalnych modyfikacji jednego z głównych białek osocza — albuminy (MICHNIK et al., 2004 a, b, 2008).
Pomiar kalorymetryczny umożliwia bezpośrednie wyznaczenie makroskopowej wielkości termodynamicznej — entalpii badanego procesu. Ze względu na kompensację entalpowo-entropową sama wartość zmian energii swobodnej Gibbsa (entalpii swobodnej), miary konformacyjnej stabilności białka nie jest wystarczająca do prawidłowego opisu termodynamiki przemiany. Znaczące udoskonalenie aparatury kalorymetrycznej oraz pojawienie się komercyjnie dostępnych kalorymetrów o wysokiej czułości, np. różnicowych kalorymetrów skaningowych DSC, charakteryzujących się czułością ułamka mikrowata, przyczyniło się do zastosowania metod kalorymetrycznych w badaniach przemian zachodzących w białkach pod wpływem temperatury. Dobrej jakości mikrokalorymetry umożliwiają detekcję nawet stosunkowo słabych, subtelnych zmian wywoływanych w energetyce tych przemian różnorodnymi czynnikami.
Mikrokalorymetr VP DSC (MicroCal Co.), stosowany w badaniach, których wyniki prezentowane są w tej pracy, należy do klasy takich wysokoczułych kalorymetrów, przeznaczonych do badania próbek w stanie ciekłym i w szczególności bardzo dobrze nadaje się do badania roztworów białek.
Obecnie zgromadzono pokaźny materiał doświadczalny dotyczący badań termicznej denaturacji białek metodą DSC. Złożoność obserwowanych przemian, ich zależność od specyfiki badanych struktur białkowych, jak i wielu czynników doświadczalnych stanowi o atrakcyjności problematyki, a jednocześnie utrudnia porównywanie wyników uzyskiwanych przez różnych autorów.
W niniejszym opracowaniu ograniczono się do zaprezentowania i przedyskutowania na podstawie dostępnych danych literaturowych zagadnień dotyczących termicznych przemian albuminy. Wiele z zawartych treści ma jednak uniwersalny charakter i ilustruje różnorodność oraz specyfikę problemów związanych z analizą procesów przebiegających w roztworach białek pod wpływem wzrostu temperatury.
Termiczne rozfałdowanie białka uważa się za przejście globalne, co oznacza, że procesowi temu w określonych warunkach ulega cząsteczka jako całość, a nie polega ono na stopniowym osłabieniu struktury ze wzrostem temperatury (JACKSON, 2006). Dla małych białek globularnych proces ich termicznej denaturacji może być często rozpatrywany jako dwustanowy, na co wskazuje zgodność entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa (PRIVALOV, 1979), tzn. że w temperaturach bliskich przejściu współistnieją dwa stany: natywny i rozfałdowany.
W przypadku większych białek, wielodomenowych lub złożonych z kilku podjednostek, opis procesu staje się bardziej skomplikowany. Jeśli wszystkie podjednostki ulegają rozfałdowaniu równocześnie, przejście nazywane jest kooperatywnym.
Kooperatywnemu rozfałdowaniu białka złożonego z n identycznych podjednostek towarzyszy efektywna zmiana entalpii na mol n-meru, czyli entalpia van’t Hoffa n razy większa od entalpii rozfałdowania pojedynczej podjednostki.
Entalpia van’t Hoffa określa stromość przejścia: im większa kooperatywność, tym większa efektywna entalpia i przejście bardziej strome.
Porównanie entalpii kalorymetrycznej i van’t Hoffa dostarcza informacji na temat liczby kooperatywnych podjednostek ujawniających się podczas przejścia.
Denaturację niektórych dużych białek można opisać jako sumę procesów denaturacji ich składowych domen.
Połączenie danych kalorymetrycznych z odpowiednim modelem teoretycznym pozwala uzyskać informacje na poziomie molekularnym. Celem autorki tej pracy było zaadaptowanie dostępnych modeli analizy dekonwolucyjnej danych kalorymetrycznych, opisanych w rozdziale 4, do opisu przemian konformacyjnych zachodzących w cząsteczce albuminy. Śledząc doniesienia literaturowe, można się dopatrzyć stosowania uproszczeń interpretacyjnych i niezgodności między modelami proponowanymi do opisu procesu termicznego rozfałdowania albuminy. Zostało to uwzględnione w dyskusji zagadnień przeanalizowanych w niniejszej pracy.
Ważnym celem podjętych prac badawczych było wykazanie różnic w przebiegu procesu termicznego rozfałdowania albuminy pozbawionej kwasów tłuszczowych oraz nieodtłuszczonej. Problem przyłączania kwasów tłuszczowych do albuminy był w ostatnich latach szeroko badany, co zrelacjonowano krótko w rozdziale D I Dodatku. Konsekwencje dowiedzionych zmian konformacyjnych albuminy, związanych z przyłączaniem kwasów tłuszczowych (CURRY et al., 1998; SUGIO et al., 1999; BHATTACHARYA et al., 2000), nie zostały jeszcze dostatecznie poznane. W bieżącej pracy dużo uwagi poświęcono dyskusji na temat odmiennych reakcji obydwu form albuminy na działanie stosowanych czynników fizykochemicznych.
Na osiągnięcie tego celu złożyło się kilka pośrednich zadań badawczych: charakterystyka termicznego rozfałdowania albuminy odtłuszczonej i zawierającej kwasy tłuszczowe w roztworach wodnych oraz w roztworach etanolu, zbadanie różnic w wiązaniu etanolu oraz porównanie wpływu promieniowania UV na różniące się zawartością kwasów tłuszczowych formy albuminy.
Aby uwiarygodnić wnioski płynące z porównania wyznaczonych parametrów termodynamicznych oraz obserwowanych tendencji ich zmian, przeprowadzono analizę statystyczną prezentowanych wyników w programie STATISTICA 7.0 (Dodatek D V).


SPIS TREŚCI :

Wprowadzenie

1. Białka: konformacja, pojemność cieplna

1.1. Stan konformacyjny białka
1.2. Pojemność cieplna białek

2. Albumina — struktura i funkcje

3. Badania DSC białek

3.1. Termiczne rozfałdowanie białka
3.2. Aspekty kinetyczne w procesie denaturacji białek — model Lumry—Eyringa

4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC

4.1. Podstawy analizy dekonwolucyjnej
4.2. Przejścia niezależne
4.2.1. Model niezależnych przejść dwustanowych, uwzględniający efekty ΔCp
4.2.2. Model niezależnych przejść dwustanowych, z wykluczeniem efektów ΔCp
4.2.3. Model niezależnych przejść niedwustanowych
4.3. Przejścia sekwencyjne
4.4. Pojedyncze przejście dwustanowe z dysocjacją podjednostek

5. Proces termicznej denaturacji albuminy w roztworach wodnych

5.1. Charakterystyka DSC termicznej przemiany pomiędzy stanem natywnym i zdenaturowanym albuminy
5.2. Specyfika termicznych przemian konformacyjnych albuminy ludzkiej i wołowej
5.3. Wpływ obecności kwasów tłuszczowych na charakter termicznego rozfałdowania albuminy
5.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy

6. Termiczna denaturacja albuminy surowicy w roztworach wodnych modyfikowanych wybranymi czynnikami chemicznymi

6.1. Przemiany BSA w roztworach o pH w zakresie 3,5—7,0
6.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w roztworach wodnych etanolu
6.2.1. Białka w roztworach wodno-alkoholowych
6.2.2. Proces termicznej denaturacji HSA i HSAf w obecności etanolu
6.2.3. Wiązanie etanolu do albuminy
6.2.4. Analiza dekonwolucyjna krzywych DSC albuminy w roztworach etanol-woda

7. Skutki ekspozycji roztworów wodnych albuminy na wybrane zakresy promieniowania elektromagnetycznego

7.1. Wpływ promieniowania o częstości radiowej na trwałość konformacji albuminy wołowej
7.2. Konformacyjna reorganizacja albuminy pod wpływem promieniowania UV

Podsumowanie

Dodatek

D I. Wiązanie kwasów tłuszczowych do albuminy
D II. Siły stabilizujące strukturę białka
D III. Wpływ środowiska na konformacyjną stabilność makromolekuły białka
D IV. Pomiary kalorymetryczne i spektrofotometryczne
D V. Analiza statystyczna wyników

Literatura

Summary
Zusammenfassung